玉米醇溶蛋白支架生物相容性及在牙周缺损修复中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.012

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (25): 3726-3731.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.012

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玉米醇溶蛋白支架生物相容性及在牙周缺损修复中的应用

李敏¹，王瑶²，王双双¹，李蓓¹，杨琳¹

¹河北省中医院，河北省石家庄市 050011；²河北医科大学第一医院，河北省石家庄市 050030

收稿日期:2016-03-25 出版日期:2016-06-17 发布日期:2016-06-17
通讯作者: 王瑶，河北医科大学第一医院口腔科，河北省石家庄市 050030
作者简介:李敏，女，1979年生，河北省宁晋县人，主治医师，主要从事口腔临床及研究工作。
基金资助:
河北省中医药管理局科研计划项目(2014028)

Biocompatibility of zein scaffold and its application in periodontal defect repair

Li Min¹, Wang Yao², Wang Shuang-shuang¹, Li Bei¹, Yang Lin¹

¹ Chinese Medicine Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China; ²First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050030, Hebei Province, China

Received:2016-03-25 Online:2016-06-17 Published:2016-06-17
Contact: Wang Yao, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050030, Hebei Province, China
About author:Li Min, Attending physician, Chinese Medicine Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China
Supported by:
the Research Planning Project of Traditional Chinese Medicine Administration of Hebei, No. 2014028

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
玉米醇溶蛋白：属于玉米中的主要蛋白质，具有其特殊的溶解特性、耐热性，选择该蛋白作为牙周缺损支架，能够发挥抑菌性、抗氧化性；同时，玉米醇溶蛋白是可食性全降解食品包装的重要材料之一，在医药及生物等领域均具有广泛的运用前景。
生物相容性：根据国际标准化组织(ISO)会议，生物相容性是指生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能，一般是指材料与宿主之间的相容性。生物材料置入人体后，对特定的生物组织环境产生影响和作用，生物组织对生物材料也会产生影响和作用，两者的循环作用一直持续，直到达到平衡或者植入物被去除。

摘要
背景：玉米醇溶蛋白具有优良的溶解性、耐热性及可降解性，但目前对其生物相容性及修复牙周炎缺损的效果尚存在较大争议。
目的：分析玉米醇溶蛋白支架的生物相容性及其修复牙周缺损的效果。
方法：采用溶剂浇铸/粒子沥滤法制备玉米醇溶蛋白支架。①体外实验：将人牙周膜细胞与玉米醇溶蛋白支架共培养18 d，扫描电镜观察细胞生长情况；②体内实验：取8只Beagle犬，制作牙周缺损模型，随机分为2组，实验组在缺损处置入玉米醇溶蛋白支架，对照组间断缝合牙龈组织。术后3个月，扫描电镜观察缺损部位。
结果与结论：①体外实验结果：人牙周膜细胞在支架上附着良好，与支架贴附紧密，呈梭形，能围绕孔隙生长，表明玉米醇溶蛋白支架具有良好的细胞相容性；②体内实验结果：实验组支架完全溶解，骨小梁排列较规则，存在成熟的修复组织且与周围组织融合较好；对照组缺损部位基本愈合，骨纤维排列不规则，存在明显骨陷窝。实验组新生牙槽骨高度、骨缺损高度、结合上皮长度显著低于对照组(P < 0.05)，新生牙骨质显著高于对照组(P < 0.05)；③结果表明：玉米醇溶蛋白支架具有良好的细胞相容性，可促进牙周缺损的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0002-8012-071X(李敏)

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 玉米醇溶蛋白支架, 生物相容性, 牙周炎, 修复效果, 骨纤维, 细胞生长, 上皮长度

Abstract:

BACKGROUND: Zein has excellent solubility, heat resistance and biodegradability, but its biocompatibility and effect on periodontal defects repair are under discussion.

OBJECTIVE: To analyze biocompatibility of zein and its effect on periodontal defect repair.

METHODS: Zein scaffold was prepared by solvent casting/particulate leaching. In vitro test: Human periodontal ligament cells were co-cultured with zein scaffold for 18 days, and cell growth was observed by scanning electron microscope. In vivo test: Eight Beagle dogs were enrolled to establish periodontal defect models, which were randomly assigned to receive zein scaffold implantation as experimental group, or interrupted suture as control group. Afterwards, the defect region was observed by scanning electron microscope at 3 months.

RESULTS AND CONCLUSION: In vitro results: Human periodontal ligament cells adhered well and tightly on the scaffold with a fusiform, and could grow around pores. In vivo results: In the experimental group the scaffold dissolved completely, bone trabecular arranged regularly, and mature tissues appeared, to be integrated with the surrounding tissues; in the control group, the defect region almost healed, but there were irregular fibers and obvious lacunae. Moreover, compared with the control group, the height of new alveolar bone and bone defect, as well as the length of junctional epithelium were significantly decreased, and new cementum was significantly increased in the experimental group (P < 0.05). To conclude, zein scaffold has good biocompatibility and can promote periodontal defect repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Zein, Materials Testing, Periodontitis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李敏，王瑶，王双双，李蓓，杨琳. 玉米醇溶蛋白支架生物相容性及在牙周缺损修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(25): 3726-3731.

Li Min, Wang Yao, Wang Shuang-shuang, Li Bei, Yang Lin. Biocompatibility of zein scaffold and its application in periodontal defect repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(25): 3726-3731.

图/表（结果） 3

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引言

牙周炎是临床上发病率较高的牙科疾病，也是造成成人牙齿丧失的主要原因，而牙齿功能的下降又会影响患者的正常生活和工作^[1-2]。目前，临床上对于牙周炎的治疗主要以控制牙菌斑、阻止病情的进一步发展为主，该方法虽然能改善患者症状，但预后较差，患者治疗依从性较差^[3-4]。早在20世纪90年代，Langer和Vacanti就提出了组织工程学，它对于器官的修复、重建组织等方面发挥了重要的作用^[5-6]。

支架材料作为组织工程学的3大要素之一，不仅能够为种子细胞提供有力的黏附和生长空间，还能够发挥结构支撑作用，积极引导组织或器官再生^[7-8]。普遍认为组织材料在选择时必须具备以下条件^[9-10]：选择的支架具有合适的体积、形态及三维立体结构^[11-12]；支架材料具有较高的孔隙率，能够为种子细胞的植入、增殖等提供良好的通道和空间；选择的支架材料必须具有优良的生物相容性，置入机体缺损部位后不会引起明显的细胞毒性和炎性反应^[13-14]。因此，除了材料本身的特性外，如何选择和制备合适的牙周炎修复支架材料对修复效果等具有深远影响。玉米醇溶蛋白是近年来研究较多的生物支架材料，它属于玉米中主要的蛋白质，具有特殊的溶解特性、耐热性，选择该蛋白作为牙周缺损支架，能够发挥抑菌性、抗氧化性^[15-16]。研究显示，玉米醇溶蛋白是可食性全降解食品包装的重要材料之一，并且在医药及生物等领域均具有广泛的运用前景^[17-18]。但目前对于玉米醇溶蛋白生物相容性及在牙周炎中的修复效果尚存在较大争议，研究相对较少^[19-20]。

实验主要探讨玉米醇溶蛋白支架的制备方法、生物相容性，研究玉米醇溶蛋白支架在牙周炎修复中的修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对照观察动物实验。

1.2 时间及地点于2014年12月至2015年9月在河北医科大学第一医院口腔科完成。

1.3 材料

实验动物：6-12月龄Beagle犬8只，体质量11.85-18.00 kg，平均(15.19±1.04) kg，雌雄随机，由河北医科大学动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为SCXK(冀)2003-0001^[21-22]。对Beagle犬进行等条件喂养，对其的处理符合《关于善待实验动物的指导下意见》中相关规则^[23-24]。将8只beagle犬随机分为实验组和对照组，每组4只。

1.4 实验方法

玉米醇溶蛋白支架的制备：将玉米醇蛋白溶于体积分数65%乙醇溶液中，加入氯化钠溶液，边加热边搅拌，搅拌过程中将凝胶体系混合均匀，浇筑到一定形状的器皿中，置于85 ℃水浴中14-18 h，然后置入37 ℃去离子水中，每4 h换液1次，采用硝酸银检测无色沉淀后继续24 h沥滤，放入37 ℃干燥箱中干燥，获得多孔玉米醇溶蛋白支架。选择粒径为180-250 µm的氯化钠作为制孔剂，充分混合均匀，搅拌，成型。将其放置在85 ℃水浴加热过夜，直到乙醇完全挥发。将获得的溶液在 37 ℃去离子水中浸泡，析出氯化钠，沉淀，放入恒温箱中干燥，获得玉米醇溶蛋白支架，消毒后备用^[25-26]。采用扫描电子显微镜观察支架孔隙的大小。

Beagle犬牙周缺损模型建立及分组处理：将8只Beagle犬采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾。以每只犬上颌54/45、下颌8743/3478颊侧作为手术部位制备牙周缺损。在每一颗牙颊侧颊侧近远中牙龈处做梯形切口，然后依次做龈沟内切口，翻开牙黏骨膜瓣，制备面积为5 mm×4 mm× 1 mm的骨缺损，刮除牙周膜及牙骨质，建立牙周缺损模型(图1)^[27-28]。待止血完成且对其缺损部位进行冲洗、清理后，对照组不做任何处理，间断缝合牙龈组织；实验组在牙周缺损部位置入玉米醇溶蛋白支架。术后肌肉注射80×10⁴ U青霉素钠，1次/d，连续注射3 d，预防损伤部位发生感染^[29-30]。

玉米醇溶蛋白支架细胞相容性实验：将获得的玉米醇溶蛋白支架放在紫外线灯下照射2 h，灭菌后移植到24孔培养板中，加入DMEM、胰蛋白酶培养液。选择埋伏阻生人下颌第3磨牙(供者对实验知情同意)，刮取根中1/3牙周膜，采用组织块法原代培养牙周膜细胞，经传代培养到生长稳定，取对数生长期细胞，以1×10⁷ L^-1细胞浓度接种于96孔培养板中进行孵育。取生长状态良好的人牙周膜细胞，终止消化后调节细胞浓度为3.5×10⁷ L^-1，并将其接种在玉米醇溶蛋白支架上(1 mL)，放置在培养箱中培养 18 d，扫描电镜下观察细胞在支架上的生长情况^[31]。

1.5 主要观察指标

玉米醇溶蛋白支架的细胞相容性：观察牙周膜细胞在玉米醇溶蛋白支架上的生长情况。

Beagle犬大体情况：术后进行常规饲养，观察犬术后基本情况。

Beagle犬新生牙骨质、新生牙槽骨、新生牙周膜组织及结合上皮长度：术后3个月，处死Beagle犬，取修复部位组织，固定后，采用扫描电镜观察组织的形态学，并对其组织学进行测量：骨缺损高度、新生牙槽骨高度、新生牙骨质高度、结合上皮长度^[32]。

1.6 统计学分析采集数据采用SPSS 18.0进行统计学处理，计数资料行χ²检验，采用n/%表示；计量资料行t 检验，采用x(_)±s表示，P < 0.05提示差异有显著性意义。

讨论

牙周炎是发生在牙齿支持组织的慢性非特异性感染性疾病，是中国成年人牙齿丧失的主要原因，对患者口腔情况具有很大的影响和潜在的危险因素。目前，对于牙周炎引起的缺损尚缺乏理想的治疗方法，常规方法主要以手术、龈下刮治为主，这些方法虽能够促进牙周支持组织再生，但预期效果不理想^[33]。近年来，组织工程技术得到飞速的发展，很多学者将其运用于牙周炎修复中，为牙周炎治疗提供了新的思路和方法^[34]。

目前，临床上支架的制备方法相对较多且每一种方法均有其优点，常用的主要包括无纺织物/纤维粘结法、溶液浇筑/粒子沥滤法、气体发泡法及快速成型法等。这些方法均有其优点，其中溶液浇筑/粒子沥滤法操作相对比较简单，在基层医院更加容易实现，能够通过控制致孔剂和支架的比例，能够更加有效地控制支架材料的孔隙率、形态及尺寸等，因此，该支架制备方法在常规支架材料制备过程中使用较多。但传统的溶液浇筑/粒子沥滤法在使用过程中也存在一些不足，如获得的支架容易导致制备厚度不够、空隙间贯通性较低等，部分学者在制备支架时存在溶剂残留等现象，不利于种子细胞的生长等。为了弥补上述支架材料制备过程中存在的不足，实验中对支架的制备方法进行了相应改进：实验中支架在制备过程中通过加热能使体系呈致孔剂均匀分布，从而能形成凝胶状，保证制备的支架超过2 mm；通过加热能够加快乙醇挥发，能提高空隙间的贯通性；有机溶剂中的乙醇毒性相对较低，通过加热能够加快其挥发，减少乙醇残留，并且制备的支架细胞毒性相对较低。

牙周组织在修复过程中影响因素较多，包括种子细胞、生长因子及支架材料等，在众多的影响因素中支架材料是影响修复效果的关键^[35]。近年来，玉米醇溶蛋白在牙周炎修复中得到应用，该物质属于是玉米中的主要蛋白，与其他材料相比具有较强的溶解特性、耐热性及成膜性^[36]。同时，玉米醇溶蛋白支架还具有良好的生物降解性和生物相容性，植入的细胞能够整齐排列在支架上，能够促进细胞的黏附、生长及分化。此外，生物材料在置入体内之前需要对材料的生物相容性进行研究^[37]。目前，检测材料生物相容性最理想的方法时采用细胞培养法。牙周膜细胞作为牙周组织中最为理想的种子细胞，能够诱导分化并直接参与牙周组织的修复^[38]。此次研究中，在显微镜下看出：DMEM培养液相对较澄清，细胞在支架上附着较好，呈梭形，能够围绕空隙生长，牙周膜细胞在玉米醇溶蛋白支架上贴附紧密，相互交错排列，均能够与周围细胞相互连接。由此看出：玉米醇溶蛋白支架具有良好的生物相容性，基本符合材料运用的基本要求。而直接接触法对材料细胞毒性的敏感性相对较高，研究中将牙周膜细胞直接接种在玉米醇蛋白支架上进行相应培养，结果显示：支架具备良好的细胞相容性，无潜在毒性，能够为牙周缺损区治疗提供有力的支持。

牙周炎治疗的最终目的是为了重建由于疾病而引起的支持组织丧失，能够形成新的结缔组织，与之相连，实现牙槽骨的再生。玉米醇溶蛋白支架制备相对比较简单，更加容易培养成活，具有良好的生物相容性，置入机体后在多种酶的生物催化作用下能够增强细胞的分泌活性，具有一定的成骨特性，能够促进牙周炎缺损部位的修复^[39]。此次实验中，实验组新生牙骨质高度显著高于对照组(P < 0.05)，结合上皮长度、骨缺损高度、新生牙槽骨高度显著低于对照组(P < 0.05)。研究结果显示，玉米醇溶蛋白支架能够使得机体牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶的活性得到进一步增强，对牙龈损伤具有一定的保护作用。此次研究中，术后3个月，玉米醇溶蛋白支架完全溶解，骨小梁排列比较规则，存在成熟的修复组织，且与周围组织融合较好；对照组缺损部位基本愈合，但骨纤维排列不规则，存在明显的骨陷窝，由此看出玉米醇溶蛋白支架在牙周炎缺损修复中的应用效果良好^[40]。

综上所述，玉米醇溶蛋白支架属于是一种能够自行降解的材料，具有良好的生物相容性，并且材料能够为细胞的寄宿、生长及分化等提供场所，该材料在牙周炎修复中能够促进缺损部位细胞生长，具有较高的临床应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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